بررسی تاثیرات داروی avastin و anti-ctgf آنتی بادی بر روی رشد و آپوپتوز سلول های اپیتلیال پیگمانته شبکیه چشم انسان

سلول های rpe جداسازی شده از کره های چشم اجساد انسانی در سنین جنینی تا نوزادی که بیش از ?? ساعت از زمان مرگ آنها نگذشته بود از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران تهیه شد و در محیط dmem/f12 غنی شده با %10 سرم جنین گوساله (fbs ) کشت شدند. در پاساژهای مشخص سلول ها تحت تاثیر محیط حاوی غلظت های مختلف anti-ctgf و avastin( anti-vegf antibody) قرار گرفته و غلظت های مورد نظر انتخاب و در مرحله پایانی اثر ترکیبی از هر دو بر روی سلول های rpe مورد بررسی قرار گرفت. در سطح رونویسی تغییرات میزان بیان vegfa ، vegfr-1 ، mmp-2، mmp-9، timp-1 ، timp-2، cathepsin d، ?-sma مورد بررسی قرار گرفت ، مقدار پروتئین های mmp-2 و mmp-9توسطwestern blot و slot blot ارزیابی شده و میزان فعالیت mmp-2 و mmp-9 تحت تاثیر تیمار های مختلف توسط zymography مورد سنجش قرار گرفت و همچنین تکثیر و مرگ سلول های rpe تیمار شده با استفاده از تکنیک elisa بررسی شد. نتایج: توسط تست ایمونوسیتوشیمی بیان مارکرهای rpe65 و 8/18cytokeratin هویت سلول ها مورد تایید قرار گرفت. سنجش elisa برای تکثیر و مرگ سلولی در غلظت های مختلف ,avastin (0.25, 0.5 and 0.8 mg/ml) و anti-ctgf (10 µg/ml) و ترکیب هر دو دارو0.8 mg/ml (avastin)/ 10 µg/ml (anti-ctgf) نشان داد که تیمار های انجام شده هیچ تاثیری از لحاظ تکثیر و مرگ سلولی بر کشت های انجام شده نداشته است. تیمارهای مربوط به (0.25, 0.5 and 0.8 mg/ml) avastin حاکی از اثر افزایشی غلظت های مختلف دارو بر میزان ترشح پروتئین mmp-2 و mmp-9 بود. در نمونه های تیماری 10 µg/ml))anti-ctgf میزان ترشح پروتئین mmp-2 کاهش یافت ولیکن دارو برمیزان ترشح mmp-9 اثر افزایشی نشان داد. در مورد ترکیب هر دو آنتی بادی0.8 mg/ml (avastin) ، 10 µg/ml (anti-ctgf) اثر کاهشی میزان ترشح mmp-2 و mmp-9 مشاهده گردید. زایموگرافی نشان داد که به ترتیب با افزایش غلظت داروی avastin فعالیت آنزیم mmp-2 افزایش می یابد اما در مورد آنتی بادی anti-ctgf شاهد اثر کاهشی آن بر روی فعالیت mmp-2 بودیم. با ترکیب هر دو آنتی بادی اثر کاهشی بسیار کمی بر روی میزان فعالیت آنزیم mmp-2 مشاهده گردید. در مورد mmp-9 باند قابل مقایسه ای در تیمارهای avastin مشاهده نشد اما اثر افزایشی anti-ctgf بر میزان افزایش فعالیت mmp-9 مشهود بود و در ترکیب هر دو آنتی بادی نیز باندها قابل مقایسه نبودند. با افزایش غلظت داروی avastin میزان بیان ژن های mmp-2, cathepsin d و vegfr-1 افزایش نشان داد اما این دارو بر روی میزان بیان ژن های ?-sma , timp-2 و vegfa اثر کاهشی داشت. در مورد ژن timp-1 هیچ اثر قابل توجه معنی داری از این دارو دیده نشد. با بررسی تیمارهای مربوط به anti-ctgf و مقایسه آنها با نمونه های کنترل اثر کاهشی آنتی بادی بر روی میزان بیان vegfa، vegfr-1 و mmp-2 و تاثیر افزایشی آن بر روی timp-1 و timp-2 مشاهده شد اما تاثیر معنی داری نسبت به ?-sma و cathepsin d ایجاد نگردید. با بررسی ترکیب هر دو آنتی بادی بر روی سلول های rpe اثر معنی داری بر روی میزان بیان mmp-2 و ?-sma مشخص نشد اما اثر افزایشی این ترکیب بر روی timp-1، timp-2، vegfr-1، cathepsin d و vegfa معنی دار بود. نتیجه گیری: داروی avastin باعث افزایش فعالیت، ترشح و بیان عوامل موثر و شناخته شده در رگزایی می گردد به طوری که با افزایش غلظت دارو این اثر افزایشی تشدید می شود و منجر به تقویت پیام های مربوط به فرآیند رگزایی گشته و انتظار میرود در in vivo شاهد افزایش رگزایی باشیم درتحقیقات انجام شده این مطلب نشان داده شد که وضعیت سلول های rpe در نحوه پاسخ دهی به avastin نقش تعیین کننده ای داشته و ممکن است پاسخ های نامناسبی و غیر منتظره ای را در مقابل avastin در فرآیند رگزایی نشان دهند. ctgfبدلیل نقش هایی که در تکثیر سلولی، مهاجرت، چسبندگی سلولی و تشکیل ماتریکس خارج سلولی ایفا می نماید به هدفی بسیار مهم برای درمان بیماری هایی که در آنها رگزایی و فرآیند فیبروز مشکل ساز می باشد تبدیل شده است. anti-ctgf با تاثیر افزایشی که بر روی timp-1 و timp-2 دارد باعث کاهش فعالیت mmp-2 ،که نقش مهمی در فرآیند رگزایی دارد، میشود و با کاهش بیان vegfa و vegfr-1 در سلول های rpe تاثیر منفی بر روی فرآیند رگزایی اعمال می نماید اما با ترکیب avastin و anti-ctgf فاکتورهای vegfa، vegfr-1 و cathepsin d که عوامل اصلی رگزایی می باشند، افزایش پیدا می کنند. اما مزیتی که استفاده از هر دو تیمار دارد این است که timp-1 و timp-2 نسبت به کنترل به میزان بسیار بیشتری بیان می شوند.